nûçe

IPTG (îsopropil-β-D-thiogalactoside) analogek substratê β-galaktosîdase ye, ku pir jêhatî ye.Di bin veguheztina IPTG de, îndukor dikare bi proteîna represorê re kompleksek çêbike, Ji ber vê yekê pêkhatina proteîna represor were guheztin, da ku ew bi gena armanc re neyê hev kirin, û gena armanc bi bandor were diyar kirin.Ji ber vê yekê divê di dema ceribandinê de giraniya IPTG çawa were destnîşankirin?Ma çi mezintir çêtir e?
Pêşî, bila em prensîba înductiona IPTG fam bikin: Operona (element) laktozê ya E. coli sê genên avahîsaziyê, Z,Y, û A dihewîne, ku bi rêzê ve β-galactosidase, permease û acetyltransferase kod dikin.lacZ laktozê hîdrolîze dike glukoz û galaktozê, an jî alo-laktozê;lacY dihêle laktoza li hawîrdorê ji parzûna xaneyê derbas bibe û bikeve xaneyê;lacA koma acetilê ji acetyl-CoA vediguhezîne β-galaktoside, ku tê de bandora Toxic radike.Wekî din, rêzek xebitandinê O, rêzek destpêkek P û genek birêkûpêk I heye. Koda genê I proteînek represor e ku dikare bi pozîsyona O ya rêzika operatorê ve girêde, da ku operon (meta) were çewisandin û zivirî.Di heman demê de cîhek girêdanê ji bo çalakkerê gena katabolîk, proteîn-CAP cîhê girêdanê yê li jor rêza destpêkî P jî heye. Rêzeya P, rêzika O û cîhê girêdana CAP bi hev re herêma birêkûpêk a operona lac pêk tînin.Genên kodker ên sê enzîman ji hêla heman devera rêzik ve têne rêve kirin da ku bigihîjin hevrêziya hilberên genê.

Di nebûna laktozê de, lac operon (meta) di rewşek represyonê de ye.Di vê demê de, represorê lac ku ji hêla rêza I-yê ve di bin kontrola rêzika promotorê PI-yê de tête diyar kirin bi rêzika O-yê ve girêdide, ku pêşî li girêdana RNA polîmeraz bi rêza P-yê digire û destpêkirina transkrîpsiyonê asteng dike;dema laktoz hebe, lac operona (meta) dikare çêbibe Di vê pergala operon (meta) de, înduktora rastîn ne laktoz bi xwe ye.Laktoz dikeve şaneyê û ji hêla β-galaktozîdazê ve tê katalîzasyon kirin ku bibe allolactose.Ya paşîn, wekî molekulek înduktor, bi proteîna represorê ve girêdide û pêkhatina proteînê diguhezîne, ku dibe sedema veqetandina proteîna represor ji rêza O û transkrîpsiyonê.Isopropylthiogalaktoside (IPTG) heman bandorê wekî allolactose heye.Ew înduktorek pir bi hêz e, ku ji hêla bakteriyan ve nayê metabolîzekirin û pir bi îstîqrar e, ji ber vê yekê ew bi berfirehî di laboratuaran de tê bikar anîn.

Meriv çawa hûrbûna çêtirîn ya IPTG-ê diyar dike?Wek mînak E. coli bigirin.
Cûreya E. coli BL21 ku bi endezyariya genetîkî ve hatî çêkirin, ku tê de pGEX-a rekombînant a erênî (CGRP/msCT) tê de, di navgîna şil a LB ya ku 50 μg·mL-1 Amp tê de heye, hate însulîn û di şevekê de li 37°C hate çandin.Çanda jorîn di nav 10 şûşeyên 50mL navgîniya şilavê ya nû ya LB ya ku tê de 50μg·mL-1 Amp tê de bi rêjeya 1:100 ji bo çanda berfirehkirinê hate vejandin, û dema ku nirxa OD600 0,6~0,8 bû, IPTG li berhevoka dawîn hate zêdekirin.Ew 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1 e.Piştî înductionê di heman germahiyê de û di heman demê de, 1 mL ji çareseriya bakteriyê jê hate girtin, û şaneyên bakteriyê bi santrîfujasyonê hatin berhev kirin û ji SDS-PAGE re hatin şandin da ku bandora hûrgelên cûda yên IPTG li ser vegotina proteînê were analîz kirin, û dûv re. kombûna IPTG bi îfadeya proteîna herî mezin hilbijêrin.
Piştî ceribandinan, dê were dîtin ku giraniya IPTG ne bi qasî ku gengaz e.Ev e ji ber ku IPTG ji bakteriyan re xwedan toksîtiyek taybetî ye.Zêdebûna konsantreyê jî dê şaneyê bikuje;û bi gelemperî, em hêvî dikin ku proteîna çareserker ku di şaneyê de bêtir were diyar kirin, ew çêtir e, lê di pir rewşan de dema ku giraniya IPTG pir zêde be, dê hejmareke mezin ji tevlêbûnê çêbibe.Beden, lê mîqdara proteîna çareserker kêm bû.Ji ber vê yekê, giraniya IPTG-ê ya herî maqûl bi gelemperî ne ew qas mezin e, ew qas çêtir e, lê hêjmara kêmtir e.
Armanca induksiyon û çandiniya cûreyên endezyariya genetîkî zêdekirina hilberîna proteîna armanc û kêmkirina lêçûn e.Vebijandina genê armanc ne tenê ji hêla faktorên xweya tîrêjê û plasmidê ve tê bandor kirin, lê di heman demê de ji hêla şert û mercên derveyî yên din ve jî, wek giraniya îndukatorê, germahiya inductionê û dema inductionê jî tê bandor kirin.Ji ber vê yekê, bi gelemperî, berî ku proteînek nenas were eşkere kirin û paqij kirin, çêtirîn e ku meriv dema induction, germahî û giraniya IPTG lêkolîn bike da ku şert û mercên guncan hilbijêrin û encamên ceribandinê yên çêtirîn bistînin.